Western一抗二抗去(qù)除液（弱堿，溫和型）

● 産品簡介：

Western一抗二抗去(qù)除液（弱堿，溫和型）(Western Antibody Stripping Buffer，weak alkaline，mild type)可(kě)以高效去(qù)除印迹膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影(yǐng)響，用于Western中轉移了蛋白(bái)膜的重複利用，可(kě)以轉一次膜，做多次Western印迹實驗，通常可(kě)以重複利用膜5-8次（PVDF膜）。使用本試劑隻需大(dà)約30分(fēn)鍾即可(kě)實現蛋白(bái)膜的重複使用，然後可(kě)以進行Western的後續操作(zuò)。

該産品具有以下幾個優點：

1.可(kě)用于昂貴或珍稀樣本的多次雜交；

2.有利于用不同抗體(tǐ)分(fēn)析單次印迹上的不同蛋白(bái)，比如(rú)不同亞型的抗體(tǐ)；

3.有利于對異常結果進行重新分(fēn)析或确認；

4.有利于糾正孵錯的抗體(tǐ)；

5.節約試劑成本，并節約時間。

各種去(qù)除液的選擇請(qǐng)點擊Western一抗二抗去(qù)除液選擇指南(nán)。

● 貯存：

   常溫貯存，有效期一年(nián)；常溫運輸。

● 用前必讀(dú)：

1. 理(lǐ)想的抗體(tǐ)去(qù)除液應該是洗脫抗體(tǐ)的同時，不洗脫膜上結合的蛋白(bái)或者不改變抗原的結合性質，但(dàn)是目前沒有一種去(qù)除液可(kě)以做到隻洗脫抗體(tǐ)，而完全不洗脫膜上結合的抗原；也沒有一種去(qù)除液可(kě)以适用于所有不同親和度的抗原抗體(tǐ)複合物。去(qù)除液洗脫能力太強，抗原也容易被洗脫；太弱，則抗體(tǐ)殘留太高。因此，從(cóng)免疫印迹膜上去(qù)除抗體(tǐ)的方案僅能用于定性用途，因爲在每個抗體(tǐ)清除循環中，或多或少都(dōu)将洗去(qù)少量膜上的蛋白(bái)。

2. PVDF膜比硝酸纖維素膜（NC膜）更堅韌，因此優先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體(tǐ)剝離(lí)的實驗。

3. 從(cóng)SDS-PAGE凝膠轉印完成後立即幹燥PVDF膜或NC膜，可(kě)改善蛋白(bái)質與膜的結合，特别推薦用于涉及多次抗體(tǐ)剝離(lí)的實驗。在第一輪抗體(tǐ)檢測之前，必須使用甲醇将幹燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST将幹燥的NC膜潤濕。已經結合有抗體(tǐ)的膜，決不能使得(de)膜幹燥，否則抗體(tǐ)分(fēn)子将與膜結合緊密，很難剝離(lí)。因此，在做完一輪ECL發光(guāng)檢測實驗後，需要用清除液清除掉膜上的抗體(tǐ)，推薦将膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。

4. 檢測時，優先檢測低豐度抗原：先孵育條帶較弱（表達較低）的蛋白(bái)，再孵育條帶明顯（表達較高）的蛋白(bái)，最後再孵育内參。

5. 如(rú)條件(jiàn)允許，下一輪的抗體(tǐ)雜交實驗選擇種屬來(lái)源不同的一抗（對應不同種屬的二抗），減少檢測的交叉反應。

6. 該清除液适用于ECL發光(guāng)檢測的膜上抗體(tǐ)清除，不适合于膜上直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不适合熒光(guāng)檢測。

● 使用說(shuō)明：

1. 在完成Western化學發光(guāng)檢測後，NC膜或PVDF膜用适量蒸餾水中震蕩漂洗5分(fēn)鍾；重複漂洗2次。

2. 棄蒸餾水，加入适量的Western一抗二抗去(qù)除液，根據下表操作(zuò)。孵育溫度和時間會明顯影(yǐng)響抗體(tǐ)去(qù)除效果，參照(zhào)下表調整。

3. 棄去(qù)除液，加入足量蒸餾水，在搖床上漂洗2次，每次5分(fēn)鍾，把去(qù)除液徹底漂洗幹淨。

  注：殘餘的去(qù)除液會影(yǐng)響後續抗原抗體(tǐ)的的結合。

4. 可(kě)選步驟：漂洗後的轉印膜孵育ECL發光(guāng)液，檢測二抗的清除效率。曝光(guāng)5-10分(fēn)鍾，膜上看(kàn)不到發光(guāng)條帶表明二抗清除得(de)比較幹淨。如(rú)果膜上能看(kàn)到條帶，重複步驟2-3。

5．繼續進行Western的後續操作(zuò)（封閉-抗體(tǐ)孵育-發光(guāng)檢測）。

   注：建議(yì)每次膜剝離(lí)後都(dōu)要進行重新封閉，以降低背景。

● 實驗示例：

樣品：K562細胞,SDS裂解液（貨号：RL1060）提取總蛋白(bái)；

電泳：4-20% RealPAGE預制膠（貨号：RTD6117-0420）電泳

轉膜：NC膜，1×RealBlot快(kuài)速轉膜液（貨号：RT5020）快(kuài)速濕轉，恒流400 mA 30 min

圖1：Western快(kuài)速封閉液（貨号：WR5020）RT 快(kuài)封  15 min；一抗：β-Actin鼠單抗 1:10000  RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min；ECL（貨号：EC2520）曝光(guāng)1秒。

圖2： Western一抗二抗去(qù)除液（弱堿，溫和型） RT 20分(fēn)鍾剝離(lí)，ECL曝光(guāng)11分(fēn)鍾，二抗去(qù)除幹淨。

圖3： Western快(kuài)速封閉液（貨号：WR5020）RT 快(kuài)封20分(fēn)鍾；一抗：PCNA鼠單抗1：5000 RT 60min，二抗羊抗鼠IgG-HRP 1:5000，ECL（貨号：EC2520）曝光(guāng)1秒。

圖4： 膜第二次剝離(lí)RT 30分(fēn)鍾，ECL自(zì)動曝光(guāng)11min ，二抗去(qù)除幹淨

圖5： Western快(kuài)速封閉液（貨号：WR5020）RT 快(kuài)封30min；一抗：GAPDH兔多抗 1:3000 60min，二抗：羊抗兔IgG-HRP RT 60min，ECL曝光(guāng)2分(fēn)16秒。

Western一抗二抗去(qù)除液（弱堿，溫和型） PVDF膜測試

樣品：K562細胞,SDS裂解液(貨号：RL1060)提取總蛋白(bái)

電泳條件(jiàn)：12% RealPAGE預制膠（貨号：RTD6117-0012）， 恒壓150 V 1×TGS  73 min

轉膜條件(jiàn)：PVDF膜 孔徑0.45μm，1×RealBlot快(kuài)速轉膜液（貨号：RT5020） 恒流400 mA 30 min

封閉：無蛋白(bái)快(kuài)速封閉液（貨号：PF1070）常溫封閉10 min

膜去(qù)除抗體(tǐ)程序：37度，搖床60rpm 10分(fēn)鍾

圖1：一抗：PCNA鼠單抗 1:5000，RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光(guāng)1秒

圖2：膜第1次清除後抗體(tǐ)去(qù)除效果檢測：膜水漂洗3次，加入5 ml抗體(tǐ)去(qù)除液去(qù)除抗體(tǐ)，TBST漂洗3次，ECL曝光(guāng)5分(fēn)鍾，膜上幾乎無可(kě)見(jiàn)條帶，說(shuō)明二抗去(qù)除幹淨。

圖3：膜第1次清除後，H3檢測： H3鼠單抗 1:10000  RT  60 min孵育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光(guāng)5秒。

圖4：膜第2次清除後，GAPDH檢測： GAPDH兔多抗 1:3000  RT 60 min孵育，羊抗兔IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光(guāng)150秒。

圖5：膜第3次清除後，PCNA檢測：PCNA鼠單抗 1:5000  RT  60 min孵育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光(guāng)1秒。