X-Gal/IPTG即用型溶液

● 産品簡介：

藍白(bái)斑篩選是重組子篩選的一種方法。現在使用的許多載體(tǐ)都(dōu)帶有一個大(dà)腸杆菌的DNA的短(duǎn)區段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞閱讀(dú)框，但(dàn)可(kě)使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影(yǐng)響功能，這種載體(tǐ)适用于可(kě)編碼β-半乳糖苷酶C端部分(fēn)序列的宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都(dōu)沒有酶活性，但(dàn)它們同時存在時，可(kě)形成具有酶學活性的蛋白(bái)質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補，稱爲α-互補。由α-互補而産生(shēng)的LacZ⁺細菌在誘導劑IPTG的作(zuò)用下，在生(shēng)色底物X-Gal存在時産生(shēng)藍色菌落，因而易于識别。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點後，幾乎不可(kě)避免地導緻無α-互補能力的氨基端片段，使得(de)帶有重組質粒的細菌形成白(bái)色菌落。這種重組子的篩選，又稱爲藍白(bái)斑篩選。如(rú)用藍白(bái)斑篩選則經連接産物轉化的鈣化菌平闆37℃倒置培養12-16hr後，含有插入片段重組質粒的細菌形成白(bái)色菌落，而沒有插入片段的質粒細菌形成藍色菌落。

● 配制方法：

50mg/ml IPTG  5ml：取250mg IPTG，溶于5ml無菌水中，過濾除菌後-20℃貯存。

20mg/ml X-Gal  5ml：取100mg X-gal，溶于5ml 二甲基甲酰胺（DMF），棕色瓶中-20℃貯存。此試劑無需滅菌。

● 實驗程序：

1 轉化平闆的制備：

向鋪好的含有相(xiàng)應抗生(shēng)素的固體(tǐ)瓊脂平闆表面加入16 μl的IPTG(50 mg/ml)、40 μl的X-gal(20 mg/ml)，使用無菌的彎頭玻璃棒将其均勻的塗開，盡量使溶解X-gal的二甲基甲酰胺揮發幹淨。

2 轉化

               i.      取部分(fēn)連接産物加到50-100 μl感受态細胞中（感受态細胞應剛從(cóng)-70℃冰箱取出放(fàng)于冰浴上，待剛剛解凍時加入連接産物，連接産物的加入量不超過感受态細胞體(tǐ)積的十分(fēn)之一），輕彈混勻，冰浴30分(fēn)鍾。

             ii.      将離(lí)心管置于精确42℃水浴90秒，取出管後立即置于冰浴中放(fàng)置2-3分(fēn)鍾，其間不要搖動離(lí)心管。

            iii.      向離(lí)心管中加入250-500 μl37℃預熱(rè)的SOC或LB(不含抗生(shēng)素)培養基，150rpm，37℃振蕩培養45分(fēn)鍾。此步目的是使質粒上相(xiàng)關的抗性标記基因表達，使菌體(tǐ)複蘇。

           iv.      将離(lí)心管中的菌液混勻，吸取100 μl加到含相(xiàng)應抗生(shēng)素的SOB或LB固體(tǐ)瓊脂培養基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的将細胞均勻塗開。待平闆表面幹燥後，倒置平闆，37℃培養12-16小時。

3 檢測

将得(de)到的白(bái)色菌落接種1-5 ml LB培養基，37℃搖床振蕩培養過夜，保存菌種後提取質粒，應用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正确。