分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì) 260/280 260/230 比值所代表意義

分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì) 260/280 260/230 比值所代表意義

核酸在波長 260 nm 處有最高吸收峰。 吸收紫外光(guāng)的性質是嘌呤環和嘧啶環的共轭雙鍵系統所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質，不論是核苷、核苷酸或核酸都(dōu)有吸收紫外光(guāng)的特性。但(dàn)紫外法不能區分(fēn) DNA 和 RNA，隻能用來(lái)鑒定核酸的純度和含量。 蛋白(bái)質由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光(guāng)。通常蛋白(bái)質的吸收高峰在 280nm 波長處，在 260nm 處的吸收值爲核酸的十分(fēn)之一或更低，故核酸樣品中蛋白(bái)質含量較低時對核酸的紫外測定影(yǐng)響不大(dà)。 RNA 的 260nm 與 280nm 吸收的比值在 2.0 以上；DNA 的 260nm 與 280nm 吸收的比值則在 1.9 左右。當樣品中蛋白(bái)質含量較高時260/280的比值即下降。如(rú)何避免吸光(guāng)值漂移讀(dú)數不穩定可(kě)能是實驗者最頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器， 表現出的吸光(guāng)值漂移越大(dà)。事(shì)實上， 分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)的設計(jì)原理(lǐ)和工(gōng)作(zuò)原理(lǐ)，允許吸光(guāng)值在一定範圍内變化，即儀器有一定的準确度和精确度。

1.核酸本身(shēn)物化性質：溶解核酸的緩沖液的 pH 值、離(lí)子濃度等在測試時，離(lí)子濃度太高也會導緻讀(dú)數漂移，因此建議(yì)使用 pH 值一定、離(lí)子濃度較低的緩沖液（如(rú) TE）可(kě)大(dà)大(dà)穩定讀(dú)數。 核酸的吸光(guāng)值受 pH 值和緩沖液離(lí)子濃度影(yǐng)響。 隻有在一定的 pH 值和低離(lí)子濃度的條件(jiàn)下（如(rú) 10 mM Tris-HCl pH 8.0 ），才能得(de)到精确的檢測結果。水的 pH 值不穩定，可(kě)能導緻檢測誤差。一些緩沖液在紫外範圍内存在自(zì)身(shēn)吸收，爲了确保準确測量，請(qǐng)使用與懸浮或洗脫樣品時相(xiàng)同的緩沖液。

2.樣品的稀釋濃度同樣是不可(kě)忽視的因素，由于樣品中不可(kě)避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在幹擾測試效果。爲了最大(dà)程度減少顆粒對測試結果的影(yǐng)響，要求核酸吸光(guāng)值至少大(dà)于 0.1A  ，吸光(guāng)值最好在 0.1-1.5 A 。在此範圍内，顆粒的幹擾相(xiàng)對較小，結果穩定。從(cóng)而意味着樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光(guāng)度計(jì)的測試範圍）。

3.操作(zuò)因素：如(rú)混合要充分(fēn)，否則吸光(guāng)值太低， 甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白(bái)液無懸浮物，否則讀(dú)數漂移劇(jù)烈；必須使用相(xiàng)同的比色杯測試空白(bái)液和樣品， 否則濃度差異太大(dà)； 換算系數和樣品濃度單位選擇一緻；不能采用窗(chuāng)口磨損的比色杯；樣品的體(tǐ)積必須達到比色杯要求的最小體(tǐ)積等多個操作(zuò)事(shì)項。

各波長具體(tǐ)含義及相(xiàng)關問(wèn)題

1. A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波長，最佳測量值的範圍爲 0.1 至 1.0。如(rú)果不在此範圍，稀釋或濃縮樣品，使之在此範圍内；如(rú)果吸光(guāng)度小于 0.05 ，檢查是否存在操作(zuò)因素（如(rú)移液不準确，樣品内有懸浮物等）影(yǐng)響。DNA 樣品的 A260  吸光(guāng)度值是否 >0.1。（請(qǐng)注意，這個值跟儀器無關，核酸的吸光(guāng)度必需大(dà)于 0.1，其值才有效和可(kě)靠，因爲樣品中的雜質和顆粒這些不純物的幹擾通常會對光(guāng)有一定吸收，其值 <0.1 ）；

2. A280nm是蛋白(bái)最高吸收峰的吸收波長， A260/A280比值可(kě)進行核酸樣品純度評估： 純 DNA 的 A260/A280 比值爲 1.8， 純 RNA爲 2.0。如(rú)果比值低，表示受到蛋白(bái)（芳香族）或酚類物質的污染，需要純化樣品。

3. A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可(kě)進行核酸樣品純度評估：純 DNA 和 RNA 的A260/A230 比值爲 2.5。若比值小于 2.0 标明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。 A230 産生(shēng)負值主要是由于在很低 DNA  濃度的溶液中的一些其他(tā)成分(fēn)的幹擾所導緻的。 在下一個測定中，需要降低樣品的稀釋度， A230 的負值會被校(xiào)正。

4. A320nm 或 A340nm 爲檢測溶液樣品的濁度和其他(tā)幹擾因子。 該值應該接近 0.0。如(rú)果不是，說(shuō)明溶液中有懸浮物， 需要純化樣品。純樣品的 A320 一般是 0。

5. A260/A280 和 A260/A230 是核酸純度的指示值。純度好的 DNA 或 RNA，在 pH7-8.5  下 A260 / A280 的比值應該在 2.0  或 2.5。純淨的樣品A260 / A280比值大(dà)于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA ）。如(rú)果比值低于 1.8  或者 2.0，表示存在 蛋白(bái)質 或者酚類物質的影(yǐng)響。 A230 表示樣品中存在一些污染物，如(rú)碳水化合物、鹽（胍鹽）等，較純淨的核酸 A260/A230的比值大(dà)于 2.0  。當 260/230<1 時，隻有兩種情況。一是胍鹽污染，二是蛋白(bái)污染。當 0.5％BSA 蛋白(bái)質污染時，蛋白(bái)污染會導緻 260 和 280 的數值都(dōu)下降，但(dàn) 260/280 的比值變化并不顯著（即是說(shuō)比值可(kě)能也在1.7-1.8）。但(dàn)蛋白(bái)殘留會導緻 230 的數值顯著上升，顯著降低 260/230 的比值。也就(jiù)是說(shuō)，如(rú)果 RNA 樣品的 260/280 ＝1.7，260 /230 ＝0.5，那麽就(jiù)應該考慮污染原因不是胍鹽殘留，而是蛋白(bái)殘留 。

6. 其他(tā)：用分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì) 測量核酸樣品 時，應該用有緩沖能力pH8.0的10mM Tris-HCl 溶解核酸樣品，不應該用水，用水稀釋核酸樣品會造成 A260/A280 比值下降。原因是低離(lí)子強度和低 pH 溶液會增加 280 nm 處的光(guāng)吸收值。