超濾離(lí)心管的使用
注：本文引自(zì)“分(fēn)子莊園”公衆号，略有修改。
超濾離(lí)心管是一種膜過濾設備，是用于分(fēn)離(lí)液體(tǐ)中不同分(fēn)子或粒子的裝置。它利用特殊的超濾膜，通過應用壓力将液體(tǐ)樣品推動穿過膜，從(cóng)而分(fēn)離(lí)不同分(fēn)子或粒子的大(dà)小，廣泛用于蛋白(bái)質、DNA和生(shēng)物分(fēn)子的濃縮、純化和脫鹽。
一、超濾與微濾
1、微濾
微濾 (Microfiltration) 涉及利用微孔膜介質去(qù)除溶液中尺寸爲 0.1 μm 至 10.0 μm 的顆粒或生(shēng)物體(tǐ)。而超濾膜的過濾範圍爲0.01μm至0.1μm。
微濾膜廣泛應用于生(shēng)物制藥行業中的預過濾和除菌過濾。 在細胞實驗中，微濾最常用于樣品和培養基的滅菌（0.1μm微濾膜可(kě)去(qù)除支原體(tǐ)）。
此外，在核酸和蛋白(bái)質分(fēn)析之前，使用微濾膜可(kě)以有效地從(cóng)細胞裂解物中去(qù)除完整的細胞和細胞碎片。 此步驟對于确保下遊應用中結果的準确性至關重要。 通過微濾，研究人(rén)員(yuán)可(kě)以獲得(de)純化的樣品，從(cóng)而提高核酸和蛋白(bái)質相(xiàng)關研究的靈敏度和特異性。
2、超濾
超濾 (Ultrafiltration) 也是一種膜過濾，通過壓力或濃度梯度等力使料液通過半透膜進行分(fēn)離(lí)。 超濾膜能夠截留尺寸範圍爲1-1000kDa（MW）的分(fēn)子，并允許鹽和水等小分(fēn)子通過。
超濾是大(dà)分(fēn)子脫鹽、濃縮最方便的方法，已經在蛋白(bái)、抗體(tǐ)、病毒、核酸、囊泡等樣品制備中建立标準操作(zuò)。與沉澱法相(xiàng)比，超濾法更爲溫和，避免了可(kě)能導緻生(shēng)物大(dà)分(fēn)子失活的相(xiàng)變。
水流的方向垂直于膜的表面，能最大(dà)限度的提高水通量，在壓力差的作(zuò)用下，水和小于膜孔的顆粒或物質透過膜，大(dà)于膜孔的顆粒則被膜截留。死端過濾随着過濾時間的延長，被截留顆粒将在膜表面形成污染層，阻塞膜孔，使過濾阻力增加，在操作(zuò)壓力不變的情況下，膜的過濾透過率将下降；而增加壓力則可(kě)能是膜破裂。因此，死端過濾隻能間歇進行，必須周期性地清除膜表面的污染物層或更換膜。又叫錯流過濾（cross flow filtration）：水流的方向平行于膜的表面，可(kě)以大(dà)量減少污染物在表面的富集，因爲水流會将其帶走，同時也減少了堵孔的概率，使膜的通量能夠保持，同時，膜上面承受的壓力也更小，可(kě)以延長膜的使用壽命。錯流過濾運行時，水流在膜表面産生(shēng)兩個分(fēn)力，一個是垂直于膜面的法向力，使水分(fēn)子透過膜面，另一種是平行于膜面的切向力，把膜面的截留物沖刷掉。因此，錯流過濾的濾膜表面不易産生(shēng)濃差極化現象和結垢問(wèn)題，過濾透過率衰減較慢(màn)。錯流過濾的運行方式比較靈活，既可(kě)以間歇運行，又可(kě)以實現連續運行。
三、超濾離(lí)心管
超濾離(lí)心管是一種利用離(lí)心力驅動中小體(tǐ)積溶液通過超濾膜，進行快(kuài)速濃縮、滲濾和緩沖液置換的裝置。 它由蓋子、過濾裝置和離(lí)心管組成。
中間的過濾裝置既可(kě)用于滲透樣品，也可(kě)以用于保留樣品。當目标分(fēn)子明顯小于濾膜孔徑時，可(kě)使用超濾離(lí)心管對大(dà)分(fēn)子污染物進行除熱(rè)源、澄清和分(fēn)離(lí)。目标樣品會透過濾膜并保留在離(lí)心管内。如(rú)果目标分(fēn)子遠(yuǎn)大(dà)于膜孔徑，則小分(fēn)子污染物将被濾除，目标分(fēn)子将集中在過濾裝置中。垂直設計(jì)的超濾膜具有更大(dà)的有效濾膜表面積，有助于快(kuài)速的樣本處理(lǐ)，獲得(de)較高的樣本回收率（通常>90%），并達到數十倍的濃縮，同時也最大(dà)程度降低了大(dà)顆粒或大(dà)分(fēn)子量物質堵塞濾膜。死體(tǐ)積設計(jì)能有效防止過度離(lí)心使樣本幹掉而造成樣本損失。
收集濾出液後，濃縮樣本（截留部分(fēn)）可(kě)通過一個簡便的倒置（上下反轉）離(lí)心步驟而實現高效回收。反轉離(lí)心回收設計(jì)使蛋白(bái)樣品，特别是小體(tǐ)積樣品得(de)到高效回收，避免槍頭吸取造成的樣品丢失或操作(zuò)錯誤。
2、超濾管的工(gōng)作(zuò)原理(lǐ)超濾管采用切向流過濾技術(shù)，是一種以篩分(fēn)爲分(fēn)離(lí)原理(lǐ)，以壓力爲推動力的膜分(fēn)離(lí)過程。用于截留水中顆粒和大(dà)分(fēn)子物質，而水和小分(fēn)子物質則允許透過膜，過濾精度在0.001-0.01μm（分(fēn)子量1kD-1000kD）範圍内，可(kě)有效除去(qù)有機(jī)溶劑或者小分(fēn)子物質，相(xiàng)反，也可(kě)以截留水中的微粒、膠體(tǐ)、細菌、熱(rè)源及高分(fēn)子聚合物。選擇超濾離(lí)心管需要考慮樣品起始量以及超濾膜的截留分(fēn)子量(MWCO)。影(yǐng)響截留和産物回收率的因素有很多，如(rú)分(fēn)子構象、帶電特性、樣品濃度、操作(zuò)條件(jiàn)等。而且超濾管上的截留分(fēn)子量隻是平均孔徑，實際孔徑是在左右正太分(fēn)布的。
一般建議(yì)選擇截留分(fēn)子量要比要濃縮的目标大(dà)分(fēn)子的分(fēn)子量小2-3倍的超濾膜，然後根據要處理(lǐ)的樣品體(tǐ)積選擇不同尺寸的超濾離(lí)心管。
爲防超濾膜幹裂和長菌，通常超濾離(lí)心管内會附帶少量甘油和疊氮化鈉用于保護和儲存，在使用前需潤洗去(qù)除。一般是向超濾裝置中加入純水、去(qù)離(lí)子水或緩沖溶液，離(lí)心使溶液完全過膜，然後離(lí)心管中的所有液體(tǐ)。如(rú)果幹擾仍然存在，可(kě)用0.1 M NaOH清洗，再用20％的乙醇清洗，最後用緩沖液或超純水水清洗并甩幹。超濾膜一旦潤濕後就(jiù)需保持濕潤避免變幹直至使用結束，如(rú)果預清洗後沒有立即使用，可(kě)用20％的乙醇浸泡保存，務必保持濾膜潤濕，防止長菌。
5、超濾管的放(fàng)置
超濾管在離(lí)心機(jī)中的擺放(fàng)需要符合切向流過濾要求，即水流方向與膜面平行。
1）水平轉子
使用水平轉子時放(fàng)置沒有特殊要求。
水平轉子又稱甩平轉子、蕩平轉子，轉頭靜(jìng)止時，處于轉頭中的離(lí)心管中心線與旋轉軸平行，轉頭旋轉加速時，離(lí)心管中心線由平行位置逐漸過渡到垂直位置，即與旋轉軸成90?角。此種轉子主要用于樣品做密度梯度離(lí)心，顆粒移動距離(lí)長，相(xiàng)應離(lí)心時間一般也較長，溶液中的組分(fēn)相(xiàng)對于管壁的位置在離(lí)心過程中和離(lí)心後不發生(shēng)改變，因此離(lí)心效果好，能夠分(fēn)離(lí)密度差小的樣品。
2）固定角轉子
使用角轉子時，雙面垂直膜超濾管放(fàng)置方式要求濾膜側向相(xiàng)對。
單面垂直膜要求濾膜膜面朝下，這樣濾膜才能發揮切向流的作(zuò)用。
有尖角的超濾管應使尖角朝上以便樣品進入尖角，讓樣品收集更加方便，此外，死體(tǐ)積設計(jì)能有效防止過度離(lí)心使樣本幹掉而造成樣本損失。固定角轉子中離(lí)心管與轉子的轉軸之間有一定的角度，角度變化範圍通常在14?-45?。此種轉子重心低，壽命長，容量較大(dà)，轉速較高，能承受的最大(dà)離(lí)心力可(kě)達800000g，主要用于分(fēn)離(lí)沉降速度有明顯差異的顆粒樣品。顆粒在扇形溶液移動的距離(lí)很短(duǎn)，碰到外壁的顆粒沿着管壁滑到管底，形成沉澱，因此這種轉子能很快(kuài)地收集沉澱物。
6、超濾管的截留分(fēn)子量和膜孔徑關系
超濾管是一種膜過濾設備，用于分(fēn)離(lí)液體(tǐ)中不同分(fēn)子或粒子的裝置。它利用特殊的超濾膜，通過應用壓力将液體(tǐ)樣品推動穿過膜，從(cóng)而分(fēn)離(lí)不同分(fēn)子或粒子的大(dà)小。這種分(fēn)離(lí)過程基于分(fēn)子截留量，也就(jiù)是膜的孔徑大(dà)小，決定了哪些分(fēn)子可(kě)以通過膜，哪些分(fēn)子被截留在膜上。
分(fēn)子截留量是表示超濾膜的選擇性的重要參數，通常以道爾頓（Da）爲單位，分(fēn)子截留率表示膜可(kě)以截留的最大(dà)分(fēn)子或粒子的大(dà)小。具體(tǐ)來(lái)說(shuō)，如(rú)果膜的分(fēn)子截留率是10kD，則該膜能夠截留分(fēn)子量小于或等于10000的分(fēn)子，而分(fēn)子量大(dà)于10000的分(fēn)子将被截留在膜上。
道爾頓是用來(lái)表示分(fēn)子質量或原子質量的單位，一個分(fēn)子的道爾頓數值大(dà)約等于其相(xiàng)對原子質量或相(xiàng)對分(fēn)子質量。
截留分(fēn)子量和孔徑之間的關系是複雜的。通常超濾膜的截留分(fēn)子量是指在一定條件(jiàn)下,某些分(fēn)子量的物質被膜截留，被截住物質的最小分(fēn)子量即爲膜的截留分(fēn)子量，用以表征膜的分(fēn)離(lí)能力；而孔徑則是反映膜的通透性的重要參數。分(fēn)子量通常用單位爲Dalton(Da)表示，而孔徑大(dà)小通常用單位爲納米(nm)表示。
超濾膜截留的分(fēn)子量10000、30000、50000 60000、100000、200000、300000、500000、1000000，對應超濾膜孔徑(μm) 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.1。也就(jiù)是說(shuō)100kd（10萬）的截留分(fēn)子量對應50nm的孔徑。
從(cóng)數據上看(kàn),似乎存在一種對應關系，如(rú)超濾膜截留分(fēn)子量爲100kD（10萬）時,對應的孔徑爲0.05μm。但(dàn)這種關系并不完全準确。因爲超濾膜的孔徑和分(fēn)子量的關聯并非簡單的線性關系，對于具體(tǐ)的過濾器或分(fēn)離(lí)膜，其材料、制備方法、孔徑大(dà)小分(fēn)布等因素都(dōu)會影(yǐng)響它們之間的關系。
7、超濾管的離(lí)心
超濾管如(rú)果離(lí)心轉速過高，可(kě)能會導緻膜甚至管子的破裂，做實驗時要根據不同品牌超濾管的說(shuō)明書(shū)中明确指出的最大(dà)轉速和離(lí)心力，調整離(lí)心轉速到超濾管的承受範圍内。
離(lí)心機(jī)的轉速與離(lí)心機(jī)的半徑以及離(lí)心力都(dōu)有關系，不同半徑的離(lí)心機(jī)，相(xiàng)同轉速出來(lái)的離(lí)心力也不一樣。離(lí)心力g和rpm（轉／min）轉換公式：g=r×11.8×10??×rpm2，其中g有時用相(xiàng)對離(lí)心力（RCF）表示。
r 爲有效離(lí)心半徑，即從(cóng)離(lí)心機(jī)軸心到離(lí)心管底的長度，單位爲厘米（cm）。
8、超濾管使用建議(yì)
1）超濾管不能進行高壓滅菌，可(kě)使用70%乙醇或環氧乙烷滅菌。
2）超濾管一般不建議(yì)重複使用超過5次。受到樣品性質的影(yǐng)響，先用0.1M的NaOH浸泡1-2h，然後用20%乙醇清洗，最後用超純水或緩沖液清洗3次，即可(kě)再用。
3、如(rú)果樣品是線性蛋白(bái)，需使用較低的離(lí)心速度和時間避免蛋白(bái)降解。
4、濃縮過快(kuài)或者過度濃縮可(kě)能會引起蛋白(bái)沉澱。建議(yì)蛋白(bái)濃縮後最終濃度不超過20mg/ml，同時降低離(lí)心速度并改用截留分(fēn)子量更大(dà)的超濾管。
建議(yì)的改進方法是：①離(lí)心力降爲推薦離(lí)心力的30%-50%；②改用截留分(fēn)子量大(dà)的超濾管(如(rú)原本選用10kD，此時可(kě)以選擇30kD)；③取出超濾管, 用吸頭反複吹吸幾次後再繼續濃縮。
6、過濾速率受到超濾管MWCO，樣品濃度，粘度，離(lí)心力和溫度的影(yǐng)響。如(rú)果樣品中固體(tǐ)含量超過5%，離(lí)心時間需要增加。當在4℃下運行時，流速大(dà)約比25℃時慢(màn)1.5倍。粘性溶液(如(rú)50%甘油)的濃縮時間大(dà)概是常規溶液的5倍。
7、如(rú)果要用超濾的方法分(fēn)離(lí)兩種蛋白(bái)，按照(zhào)經驗，兩個蛋白(bái)的分(fēn)子量要相(xiàng)差一個數量級（10 倍）。
8、擔心濃縮過程中目的蛋白(bái)和超濾膜之間可(kě)能存在非特異性吸附，可(kě)嘗試以下操作(zuò)：①确保蛋白(bái)濃度不要過低；②盡量選用纖維素的低吸附超濾；③選用小體(tǐ)積超濾管，通過減小膜面積來(lái)降低非特異性吸附；④使用前可(kě)以先對膜進行封閉：1%脫脂奶粉，1%BSA，5%Tween 20，5%SDS，5%TritonX-100，5%PEG3000（不影(yǐng)響蛋白(bái)活性，不影(yǐng)響蛋白(bái)後續使用的前提下）。
9、對于有些樣品含量非常少的情況，可(kě)嘗試一下操作(zuò)：①盡量選擇較小的截留分(fēn)子量的超濾管；②選擇帶有尖角收集器的超濾管以便最大(dà)限度回收樣品；③使用水平轉子優于角轉子；④濃縮完用緩沖液清洗多次回收, 注意移液器的槍頭不要碰到膜，以免膜破裂；⑤使用前可(kě)以先對膜進行封閉。