細胞增殖-毒性檢測試劑盒

Cell Counting Kit-8(CCK-8)

● 産品組成：

●  産品簡介：

CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快(kuài)速高靈敏度檢測試劑盒。 WST-8是一種類似于 MTT的化合物，在電子耦合試劑1-Methoxy PMS存在的情況下，可(kě)以被還(hái)原生(shēng)成橙黃(huáng)色水溶性的甲臜（Formazan）。細胞增殖越多越快(kuài)，則顔色越深；細胞毒性越大(dà)，則顔色越淺。對于同樣的細胞，顔色的深淺和細胞數目呈線性關系。

WST-8與傳統的MTT，XTT，MTS，WST-1相(xiàng)比有明顯的優點。首先，反應生(shēng)成的formazan是水溶性的，可(kě)以省去(qù)後續的溶解步驟。其次，WST-8更加穩定，檢測線性範圍更寬，靈敏度更高。

本試劑盒可(kě)以用于細胞因子等誘導的細胞增殖檢測，也可(kě)以用于抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，或一些藥物誘導的細胞生(shēng)長抑制檢測。

本試劑盒檢測便捷，使用方便。僅含一管已經配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，無須再進行任何配制等操作(zuò)。無須使用同位素，所有的檢測步驟僅在同一塊96孔闆内完成。不必洗滌細胞，不必收集細胞，也不必采用額外的步驟去(qù)溶解甲臜。特别适用于大(dà)批量樣品的檢測。

另外，酚紅(hóng)和血清對本試劑盒的測定無明顯影(yǐng)響。

WST-8對細胞無明顯毒性。加入CCK-8溶液顯色後，可(kě)以在不同時間反複用酶标儀讀(dú)闆，使檢測時間更加靈活，便于找到最佳測定時間。

本試劑盒可(kě)以測定100個或500個樣品。

●  保存條件(jiàn)：

CCK-8 溶液在避光(guāng)，0-5℃的條件(jiàn)下可(kě)以保存一年(nián)，如(rú)長期保存，可(kě)在-20℃下保存 2 年(nián)，如(rú)需經常使用請(qǐng)将試劑存放(fàng)在 0-5℃，爲防止背景值增加幹擾實驗結果，請(qǐng)勿反複凍融。

● 操作(zuò)步驟：

1.  在 96孔闆中接種細胞懸液(100 μl /孔)，通常細胞增殖實驗每孔約2000 個細胞，細胞毒

性實驗每孔約5000 個細胞，具體(tǐ)每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大(dà)小，細胞增殖速度的快(kuài)慢(màn)等因素決定)。

2.  按照(zhào)實驗需要，進行培養并給予0-10 μl特定的藥物刺激，處理(lǐ)一段适當的時間(例如(rú): 6,12,

24或48小時)。

3.  每孔加入10 μl CCK-8 溶液。如(rú)果起始的培養體(tǐ)積爲200 μl，則需加入20 μl CCK-8溶液，以此類推。可(kě)以用加相(xiàng)應量細胞培養基和 CCK-8但(dàn)不加細胞的孔作(zuò)爲空白(bái)對照(zhào)，若擔心所使用的藥物會幹擾檢測，需設置加相(xiàng)應量細胞培養液、藥物和 CCK-8 溶液但(dàn)不加細胞的孔作(zuò)爲空白(bái)對照(zhào)。

4.  在細胞培養箱内繼續孵育1-4小時，具體(tǐ)時間可(kě)以通過預實驗确定。預實驗時可(kě)以在0.5、

2和4 小時後分(fēn)别用酶标儀檢測，然後選取吸光(guāng)度範圍比較适宜的一個時間點用于後續實驗。

5.  用酶标儀測定在450 nm處的吸光(guāng)值，若無450nm濾光(guāng)片，可(kě)以使用420-480nm 的濾光(guāng)

片。如(rú)果樣品爲高渾濁度的細胞懸液，可(kě)以使用大(dà)于 600nm的波長，例如(rú)650nm，作(zuò)爲參考波長進行雙波長測定。

6.  如(rú)果需要暫時不測定 OD值，可(kě)以向每孔中加入10 μl0.1MHCl 溶液或者1%(w/v)的 SDS溶液，避光(guāng)保存在室溫，24 小時内吸光(guāng)度不會發生(shēng)變化。  

● 注意事(shì)項：

1.  使用96 孔闆進行檢測時，如(rú)果細胞培養時間較長，請(qǐng)注意蒸發問(wèn)題。可(kě)将96 孔闆外圍一圈加培養基、水或 PBS保濕。同時，可(kě)以把96孔闆置于培養箱内靠近水盤的位置以緩解蒸發。

2.  培養時間根據細胞種類的不同和每孔内細胞數量的多少而不同。在正式實驗前，建議(yì)先做預實驗摸索鋪闆的細胞數量以及加入CCK-8 試劑後的培養時間。

3.  鋪闆時請(qǐng)注意保證每個孔細胞數量均勻，建議(yì)鋪闆過程中注意時常混勻，防止因細胞沉澱造成不均勻。加入CCK-8 後請(qǐng)前後左右輕輕晃動培養闆數次，使培養基和CCK-8 溶液充分(fēn)混勻。

4.  本試劑盒的檢測依賴于脫氫酶催化的反應，如(rú)果待測物質有氧化性或還(hái)原性，可(kě)在加CCK-8  之前更換新鮮培養基，去(qù)掉藥物的影(yǐng)響。若藥物影(yǐng)響比較小的情況可(kě)以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物後的空白(bái)吸收即可(kě)。

5.  加入CCK-8 時，如(rú)果細胞培養時間較長，培養基顔色或 pH值已變化，建議(yì)換用新鮮的培養基。

6.  用酶标儀檢測前需确保每個孔内沒有氣泡，否則會幹擾測定。

7.  本試劑盒系無菌灌裝生(shēng)産。在使用過程中，請(qǐng)在生(shēng)物安全櫃内無菌操作(zuò)，避免污染。