RNA尿素電泳推薦電泳Marker：單鏈RNA Marke（貨号：RTM505）
RNA尿素PAGE電泳試劑盒（貨号RTE4103）
RNA Urea PAGE Electrophoresis Kit
● 産品組成：
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序号
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貨号
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名稱
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規格
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保存條件(jiàn)
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1
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RTE4103-01
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40%PAA(29:1) （RNase-free）
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100 ml
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4℃
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2
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RTE4103-02
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10×TBE（RNase-free）
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500 ml
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RT
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3
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RTE4103-03
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尿素（電泳級）
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RT
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4
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RTE4103-04
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RNase-free水
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100 ml
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4℃
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5
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RTE4103-05
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2×RNA上樣緩沖液
(尿素變性膠，RNase-free)
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1 ml
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-20℃
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6
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RTE4103-06
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RNA核酸染料
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0.5 ml
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4℃
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7
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AP020P
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APS（幹粉）
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5 ml
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RT (配制後-20℃貯存)
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8
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TA0761
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光(guāng)
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9
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說(shuō)明書(shū)
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一份
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● 産品簡介：
核酸尿素 PAGE 電泳是研究寡核苷酸和RNA電泳的重要研究手段。可(kě)以檢測2-500堿基的寡核苷酸或RNA片段，理(lǐ)論上可(kě)以分(fēn)辨出相(xiàng)差一個核苷酸的片段。
本公司提供的RNA尿素PAGE電泳試劑盒包含凝膠制備及電泳所需的全部試劑，用戶隻需自(zì)備制膠器具和蒸餾水，即可(kě)配制各種濃度的PAGE膠，使用方便。
按照(zhào)每次制備7 ml 8%凝膠（大(dà)小10×8cm，1mm厚度）計(jì)算，試劑盒可(kě)使用至少60次。
● 貯存和運輸：
試劑盒按照(zhào)标簽溫度貯存，有效期一年(nián)。試劑盒常溫運輸。
● 使用說(shuō)明：
一、制備凝膠：
10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS幹粉溶于5 ml RNase-free水中，徹底溶解後分(fēn)裝，1 ml/支，-20℃備存，每次取一管使用。10% APS應盡量減少室溫存放(fàng)時間，以防失效。10%APS在4℃有效期爲一周，-20℃有效期6個月。若發現凝膠聚合時間延長，應考慮更換使用-20度保存的10% APS。
1.1．參照(zhào)凝膠模具說(shuō)明書(shū)，裝配好凝膠模具。
1.2．分(fēn)離(lí)膠配制：根據表格一，将不同體(tǐ)積的成分(fēn)混合，漩渦攪拌至尿素徹底溶解。
表一 TBE-尿素PAGE分(fēn)離(lí)膠配方表 (總體(tǐ)積5 ml，适用于厚度1.0 mm小闆膠)
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RNA長度
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最佳凝膠濃度
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尿素(克)
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40%PAA
（29:1）
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10×TBE
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RNase-free水
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10%APS
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TEMED
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200-1000 nt
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5%
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2.1克
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0.625 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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50-400 nt
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8%
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2.1克
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1 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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30-300 nt
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10%
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2.1克
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1.25 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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40-200 nt
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12%
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2.1克
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1.5 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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10-150 nt
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15%
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2.1克
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1.875 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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6-100 nt
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20%
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2.1克
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2.5 ml
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0.5 ml
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至體(tǐ)積5 ml
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50 μl
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5 μl
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1.3在凝膠模具中灌入适量分(fēn)離(lí)膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可(kě)），然後在分(fēn)離(lí)膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
1.4靜(jìng)置10-20分(fēn)鍾，待分(fēn)離(lí)膠和水層之間出現一個清晰的界面後，說(shuō)明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
1.5去(qù)除覆蓋在分(fēn)離(lí)膠上的水層；按照(zhào)表二将不同體(tǐ)積成分(fēn)在一個小燒杯中混合；最後加入10%過硫酸铵和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體(tǐ)積2 ml，适用于1.0mm厚度膠)
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各組份體(tǐ)積（ml）
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尿素
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40%PAA（29:1）
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10×TBE
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RNase-free水
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10%APS
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TEMED
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0.84克
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0.2 ml
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0.2 ml
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補至體(tǐ)積2 ml
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20 μl
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2 μl
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1.6将濃縮膠溶液加至分(fēn)離(lí)膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃闆的頂端；将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。
1.7常溫靜(jìng)置30-60分(fēn)鍾，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
二、電泳：
2.1. 預電泳：拔出梳子，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次，去(qù)除殘餘的尿素。電泳槽内外加入适量1×TBE緩沖液穩壓200 V預電泳30分(fēn)鍾。
注：試劑盒配套的10×TBE緩沖液和RNase-free水僅夠配制凝膠用，1×TBE電泳緩沖液原料和RNase-free水請(qǐng)自(zì)己準備，配方如(rú)下：
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終濃度
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順序
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原料
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1升
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5 升
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89 mM
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1
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Tris堿 [MW121.14]
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10.8 克
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54克
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2 mM
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2
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EDTA 2Na·2H2O [MW372.24]
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0.744 克
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3.72克
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89 MM
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3
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硼酸 [MW61.83]
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5.5 克
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27.5克
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4
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RNase-free水最後定容至
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1 升
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5 升
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最後pH在8.2-8.3之間，可(kě)以不用調節pH，記錄每批pH
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2.2. 取 3-5 μl樣品，加入等體(tǐ)積2×RNA上樣緩沖液，70℃處理(lǐ)5分(fēn)鍾後立即冰浴，上樣。
2.3. 連接電源線，打開電源開關，按照(zhào)以下條件(jiàn)電泳。
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時間
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适用條件(jiàn)
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推薦電壓
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200V
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15-20 mA/闆膠
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8-15 mA/闆膠
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50+ min
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最佳電壓，最優的分(fēn)辨率
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2.4. 根據下表溴酚藍指示前沿位置判斷條帶位置，取出凝膠進行後續實驗。
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變性膠濃度
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溴酚藍
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二甲苯菁
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5%
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35 nt
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130 nt
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8%
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19 nt
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75 nt
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10%
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15 nt
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55 nt
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12%
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12 nt
|
55 nt
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15%
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10 nt
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52 nt
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20%
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5 nt
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50 nt
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三、染色：
3.1染色液配制：取一合适的容器，加入100 ml 1×TBE，随後加入10 μl RNA核酸染料混勻。
3.2 染色：取下凝膠放(fàng)入染色液中，常溫下搖床輕輕地搖動凝膠染色，最佳的染膠時間爲15-20 分(fēn)鍾，這取決于凝膠的厚度、聚丙烯酰胺的濃度和 RNA 的長短(duǎn)。凝膠越厚或聚丙烯酰胺的濃度越高，染色所需要的時間就(jiù)越長。注：染色溶液至少可(kě)重複使用2-3次。如(rú)果不立即再用的話(huà)，建議(yì)将用過的染色溶液冷(lěng)藏避光(guāng)保存。
3.3 觀察：紫外燈下觀察條帶。
