細菌基因組DNA提取試劑盒（目錄号：RTG2401）

● 試劑盒内容及保存：

● 儲存、效期及運輸：

本試劑盒在常溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下，可(kě)保存1年(nián)；更長時間的保存可(kě)置于2-8℃。2-8℃保存條件(jiàn)下，若溶液産生(shēng)沉澱，應在使用前置于37℃下溶解沉澱至溶液澄清後再使用。單獨包裝的蛋白(bái)酶K、溶菌酶和RNaseA收到後-20℃保存。

蛋白(bái)酶K、溶菌酶和RNase A濕冰運輸，其餘組份常溫運輸。

● 産品簡介：

本試劑盒采用可(kě)以特異性結合DNA的離(lí)心吸附柱和獨特的緩沖液系統提取細菌（革蘭氏陽性菌和陰性菌）的基因組DNA。溶菌酶能有效去(qù)除細菌細胞壁；蛋白(bái)酶K能把核酸解離(lí)出來(lái)； RNaseA能去(qù)除痕量的RNA污染；離(lí)心吸附柱能夠高效、專一吸附DNA，最大(dà)限度去(qù)除雜質蛋白(bái)及細胞中其他(tā)有機(jī)化合物，提取的基因組DNA片段大(dà)，純度高，質量穩定可(kě)靠。

使用本試劑盒回收的DNA可(kě)适用于各種常規操作(zuò)，包括酶切、PCR、文庫構建、Southern雜交等實驗。

● 提取得(de)率：

● 準備工(gōng)作(zuò)：

1. 準備55℃和70℃水浴；無水乙醇；1.5 ml滅菌離(lí)心管。

2. 按照(zhào)标簽所示在去(qù)蛋白(bái)液GD和漂洗液PW中加入無水乙醇，混勻後蓋緊瓶蓋後室溫貯存備用。

3. 每次使用前請(qǐng)檢查緩沖液GA，緩沖液GB和去(qù)蛋白(bái)液GD是否有沉澱生(shēng)成，如(rú)果出現沉澱，37℃溫浴至沉澱溶解後再使用。

● 操作(zuò)步驟：

如(rú)非指出，所有離(lí)心步驟均爲使用台式離(lí)心機(jī)在室溫下離(lí)心。

1. 取細菌培養液1-2 ml，10,000 g離(lí)心1分(fēn)鍾，盡量吸淨上清；向細菌沉澱中加入180 μl EB，旋渦混勻後加入18 μl 溶菌酶，室溫放(fàng)置10-15分(fēn)鍾，期間間歇混勻幾次。

注：溶菌酶的用量和處理(lǐ)時間與處理(lǐ)的細菌種類密切相(xiàng)關，用戶可(kě)以根據細菌種類進行調節。如(rú)革蘭氏陽性菌應将處理(lǐ)時間延長到30-60分(fēn)鍾。

2.10,000g離(lí)心1分(fēn)鍾，吸棄大(dà)部分(fēn)上清，留下約10 μl液體(tǐ)，徹底混勻。

   注：由于餘留的液體(tǐ)較少，徹底混勻菌體(tǐ)不太容易，用手指彈動管壁附加槍頭反複吹打既能完全混勻菌體(tǐ)。混勻一定要徹底，否則容易導緻步驟8中離(lí)心柱堵塞。

3. 向菌體(tǐ)沉澱中加入200 μl緩沖液GA，混勻。

4. 向管中加入20 μl 蛋白(bái)酶K，混勻，55℃處理(lǐ)15-30分(fēn)鍾，期間間歇混勻2-3次至溶液清亮。

   注：加入蛋白(bái)酶K後會産生(shēng)絮狀物，消化徹底的标志是絮狀物完全消失，溶液變清亮。如(rú)消化不徹底，會導緻步驟8中離(lí)心柱堵塞。

5. 加入10 μl RNaseA（10 mg/ml）溶液，混勻後室溫放(fàng)置2分(fēn)鍾。

6. 加入220 μl緩沖液GB，混勻，70℃放(fàng)置10-30分(fēn)鍾（對于革蘭氏陽性菌，時間應延長到60分(fēn)鍾）。

注：加入緩沖液GB時可(kě)能會産生(shēng)白(bái)色沉澱，一般70℃放(fàng)置相(xiàng)應時間後溶液會變清亮。如(rú)溶液未變清亮，應延長70℃處理(lǐ)時間。如(rú)果絮狀物不能處理(lǐ)幹淨，容易導緻步驟8中離(lí)心柱的堵塞。

7. 加入220 μl無水乙醇，充分(fēn)混勻。

注：加入乙醇後會産生(shēng)絮狀沉澱，可(kě)用槍頭反複抽打1-2次将沉澱弄碎後再上柱。如(rú)果絮狀物未做處理(lǐ)，容易導緻步驟8中離(lí)心柱的堵塞。

8. 将上一步所得(de)溶液和絮狀沉澱加入到吸附柱CG中（吸附柱放(fàng)入收集管中），11,000g離(lí)心5分(fēn)鍾，倒掉廢液，吸附柱CG放(fàng)入收集管中。

注：如(rú)果出現吸附柱堵塞現象，可(kě)将離(lí)心時間延長到10分(fēn)鍾。

9. 向吸附柱CG中加入500 μl去(qù)蛋白(bái)液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），11,000 g離(lí)心2分(fēn)鍾，倒掉廢液，吸附柱放(fàng)入收集管中。

10. 向吸附柱CG中加入700 μl漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），11,000 g離(lí)心60秒，倒掉廢液，吸附柱放(fàng)入收集管中。

11. 向吸附柱CG中加入500 μl 漂洗液PW，11,000 g離(lí)心60秒，倒掉廢液。

12. 吸附柱CG放(fàng)回收集管中，11,000 g離(lí)心2分(fēn)鍾。

注：此步驟非常重要，其目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去(qù)除。漂洗液中乙醇的殘留會影(yǐng)響後續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。

13. 将吸附柱CG轉入一個幹淨的1.5 ml離(lí)心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50–100 μl經70℃水浴預熱(rè)的洗脫緩沖液EB，室溫放(fàng)置2分(fēn)鍾，11,000 g離(lí)心2分(fēn)鍾。

注； = ① 洗脫緩沖液體(tǐ)積最好不少于50 μl，體(tǐ)積過小影(yǐng)響回收效率。

=  ② 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大(dà)影(yǐng)響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍内，pH值低于7.0會降低洗脫效率。

14. DNA産物-20℃保存。

● DNA濃度及純度檢測：

基因組DNA片段的大(dà)小與樣品保存時間、操作(zuò)過程中的剪切力等因素有關。提取的DNA片段可(kě)用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)檢測濃度與純度。可(kě)配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大(dà)小，完整的基因組大(dà)小應在23 kb以上。使用分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計(jì)檢測時， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應爲1.7-1.9之間，如(rú)果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去(qù)離(lí)子水洗脫，比值可(kě)能偏低，但(dàn)并不表明DNA純度不高。