高純質粒小提試劑盒（目錄号：RTP2101）

● 試劑盒内容及保存：

● 儲存條件(jiàn)和效期：

本試劑盒在室溫（25℃左右）幹燥條件(jiàn)下，可(kě)保存1年(nián)；更長時間的保存可(kě)置于2–8℃。2–8℃保存條件(jiàn)下，若溶液産生(shēng)沉澱，應在使用前置于37℃下溶解沉澱至溶液澄清後再使用。單獨包裝的RNase A 在-20℃可(kě)穩定保存1年(nián)以上。加入RNase A後的溶液P1應置于2–8℃保存，可(kě)穩定保存半年(nián)。

● 産品簡介及使用說(shuō)明：

本試劑盒采用經典的堿裂解法裂解細菌，再通過離(lí)心吸附柱在高鹽狀态下特異性地結合DNA的特性，可(kě)以從(cóng)1–5ml大(dà)腸杆菌LB培養液中快(kuài)速提取3–20μg純淨的高拷貝質粒DNA。提取的質粒可(kě)适用于各種常規操作(zuò)，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等實驗。然而，對質粒純度要求更高的轉染實驗（要求無内毒素），此試劑盒不能達到要求。另外，盡管該試劑盒可(kě)以抽提較大(dà)的質粒（>10kb），但(dàn)我們不推薦使用。如(rú)果一定要使用，請(qǐng)參考以下方法：加大(dà)菌體(tǐ)使用量（使用5–10 ml過夜培養物），同時按照(zhào)比例增加P1、P2、P3的用量；洗脫緩沖液應在70℃預熱(rè)，在吸附和洗脫時可(kě)以适當的延長時間，以增加提取效率，其它步驟相(xiàng)同。

● 産品特點：

1使用了Lysis Dye，菌體(tǐ)裂解是否完全一目了然。由于判斷菌體(tǐ)裂解和中和是否徹底更主要取決于操作(zuò)者的經驗，所以我們增加了Lysis Dye（一種能使裂解/中和體(tǐ)系變換顔色的試劑）來(lái)幫助觀察裂解/中和的程度。加入P1後，Lysis Dye使菌液變爲渾濁的紅(hóng)色；加入P2後，Lysis Dye立即使溶液變爲澄清的紅(hóng)色，裂解是否完全隻要觀察紅(hóng)色溶液是否澄清，如(rú)果紅(hóng)色非常均一，表明裂解充分(fēn)；在完全裂解的體(tǐ)系中加入P3混勻後，體(tǐ)系立即變爲黃(huáng)色，任何紅(hóng)色的殘留表明沒有完全混勻或者中和不徹底。

2 增加了去(qù)蛋白(bái)液PD，能更加徹底地去(qù)除蛋白(bái)污染，得(de)到純度更高的質粒。

● 準備工(gōng)作(zuò)：

1 将試劑盒附帶的RNase A全部加入到溶液P1中（如(rú)15ml P1中加入150μl RNase A），混勻後4℃貯存。

2 按照(zhào)标簽所示在漂洗液PW中加入無水乙醇，混勻後蓋緊瓶蓋後室溫貯存備用。

3 每次使用前請(qǐng)檢查溶液P2，溶液P3和去(qù)蛋白(bái)液PD是否有沉澱生(shēng)成，如(rú)果出現沉澱，37℃溫浴至沉澱溶解後再使用。

● 使用Lysis Dye的标準操作(zuò)步驟：

如(rú)非指出，所有離(lí)心步驟均爲使用台式離(lí)心機(jī)在室溫下離(lí)心。

1．   取1–5 ml過夜培養的菌液加入離(lí)心管中，10,000g 離(lí)心1分(fēn)鍾，盡量吸除上清。

注：菌液較多時可(kě)以通過幾次離(lí)心将菌體(tǐ)沉澱收集到一個離(lí)心管中。

2．   向菌體(tǐ)沉澱的離(lí)心管中加入250 μl溶液P1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA）和5μl Lysis Dye，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉澱，此時溶液爲渾濁的紅(hóng)色。

注：如(rú)果有未徹底混勻的菌塊，會影(yǐng)響裂解，導緻提取量和純度偏低。

3．   加入250 μl溶液P2，溫和地上下翻轉6–8次使菌體(tǐ)充分(fēn)裂解，此時溶液變爲澄清的紅(hóng)色。

注：溫和地混合，不要劇(jù)烈震蕩，以免污染基因組DNA；所用時間絕對不應超過5分(fēn)鍾 ，以免質粒受到破壞；紅(hóng)色溶液應該透明均一，如(rú)有渾濁紅(hóng)色顆粒，表明裂解不充分(fēn)，會大(dà)大(dà)降低質粒提取效率。

4．   加入350 μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉，充分(fēn)混勻，混勻充分(fēn)的标志是溶液完全呈透明的黃(huáng)色，如(rú)有可(kě)見(jiàn)紅(hóng)色，說(shuō)明混勻不徹底。10,000g 離(lí)心10分(fēn)鍾。

注：P3加入後應立即混合，避免産生(shēng)局部沉澱。

左側未完全混勻，有紅(hóng)色；右側完全混勻，呈均勻黃(huáng)色

5．  小心地将上清轉移到吸附柱CP中（吸附柱放(fàng)入收集管中），10,000g離(lí)心30–60秒，倒掉收集管中的廢液，将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中。

6．向吸附柱CP中加入500 μl去(qù)蛋白(bái)液PD，10,000g離(lí)心30秒，倒掉收集管中的廢液，将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中。

7．  向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），10,000g 離(lí)心30–60秒，倒掉收集管中的廢液，将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中。

8. 向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW，10,000g 離(lí)心30–60秒，倒掉收集管中的廢液。

9.  将吸附柱CP置于重新放(fàng)回收集管中，10,000g 離(lí)心2分(fēn)鍾。

注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去(qù)除，絕對不可(kě)省略，因爲漂洗液中乙醇的殘留會影(yǐng)響後續實驗（酶切，PCR等）。

10. 将吸附柱CP置于一個幹淨的1.5ml離(lí)心管中，向吸附膜的中央部位懸空滴加50–100 μl洗脫緩沖液EB，室溫放(fàng)置2分(fēn)鍾，10,000g 離(lí)心2分(fēn)鍾将質粒溶液收集到離(lí)心管中，-20℃保存。

注：● 爲了增加質粒的回收效率，可(kě)将得(de)到的洗脫液重新加入離(lí)心吸附柱中，再次離(lí)心收集。

● 洗脫緩沖液體(tǐ)積不應少于50 μl，體(tǐ)積過小影(yǐng)響回收效率。

● 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大(dà)影(yǐng)響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍内，pH值低于7.0會降低

洗脫效率。

●不使用Lysis Dye的标準操作(zuò)步驟：

如(rú)非指出，所有離(lí)心步驟均爲使用台式離(lí)心機(jī)在室溫下離(lí)心。

1．   取1–5 ml過夜培養的菌液加入離(lí)心管中，10,000 g離(lí)心1分(fēn)鍾，盡量吸除上清。

注：菌液較多時可(kě)以通過幾次離(lí)心将菌體(tǐ)沉澱收集到一個離(lí)心管中。

2．   向菌體(tǐ)沉澱的離(lí)心管中加入250 μl溶液P1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉澱。

注：如(rú)果有未徹底混勻的菌塊，會影(yǐng)響裂解，導緻提取量和純度偏低。

3．  加入250 μl溶液P2，溫和地上下翻轉6–8次使菌體(tǐ)充分(fēn)裂解。

注：溫和地混合，不要劇(jù)烈震蕩，以免污染基因組DNA；所用時間絕對不應超過5分(fēn)鍾，以免質粒受到破壞。

4．   加入350 μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉6–8次，充分(fēn)混勻，此時會出現白(bái)色絮狀沉澱。10,000g 離(lí)心10分(fēn)鍾。

注：P3加入後應立即混合，避免産生(shēng)局部沉澱。如(rú)果上清中還(hái)有微小白(bái)色沉澱，可(kě)再次離(lí)心後取上清。

5．  小心地将上清轉移到吸附柱CP中（吸附柱放(fàng)入收集管中），10,000g 離(lí)心30–60秒，倒掉收集管中的廢液，将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中。

6．向吸附柱CP中加入500 μl去(qù)蛋白(bái)液PD，10,000g離(lí)心30秒，倒掉收集管中的廢液，将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中。

7．   向吸附柱CP中加入700 μl漂洗液PW（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），10,000g 離(lí)心30–60秒，倒掉收集管中的廢液，将吸附柱CP重新放(fàng)回收集管中。

7      向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW，10,000g 離(lí)心30–60秒，倒掉收集管中的廢液。

8.  将吸附柱CP置于收集管中，10,000g 離(lí)心2分(fēn)鍾。

注：此步驟目的是将吸附柱中殘餘的漂洗液去(qù)除，絕對不可(kě)省略，因爲漂洗液中乙醇的殘留會影(yǐng)響後續實驗（酶切，PCR等）。

9．   将吸附柱CP置于一個幹淨的1.5ml離(lí)心管中，向吸附膜的中央部位懸空滴加50–100 μl洗脫緩沖液EB，室溫放(fàng)置2分(fēn)鍾，10,000g離(lí)心2分(fēn)鍾将質粒溶液收集到離(lí)心管中，-20℃保存。

注：● 爲了增加質粒的回收效率，可(kě)将得(de)到的洗脫液重新加入離(lí)心吸附柱中，再次離(lí)心收集。

● 洗脫緩沖液體(tǐ)積不應少于50 μl，體(tǐ)積過小影(yǐng)響回收效率。

● 洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大(dà)影(yǐng)響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5範圍内，pH值低于7.0會降低洗脫效率。