Blue Native PAGE凝膠電泳常見(jiàn)問(wèn)題

Blue Native PAGE凝膠電泳常見(jiàn)問(wèn)題

1. 在非變性條件(jiàn)下，使用Blue Native PAGE凝膠進行非變性電泳比使用Tris-甘氨酸凝膠具有哪些優勢？

需要使用非離(lí)子洗滌劑進行增溶的樣品不能兼容傳統的非變性Tris-甘氨酸PAGE，因爲随着蛋白(bái)質在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移，會将非離(lí)子洗滌劑遺留在條帶上方。當缺少非離(lí)子洗滌劑時，蛋白(bái)質會聚集并在泳道頂部形成垂直線條。當使用藍色非變性電泳（Blue Native PAGE凝膠）時，Coomassie G-250可(kě)顯著減少蛋白(bái)質的聚集，有效分(fēn)離(lí)膜上的蛋白(bái)質複合物，達到Tris-甘氨酸凝膠上得(de)不到的效果。此外，與Tris-甘氨酸系統的工(gōng)作(zuò)pH（pH 9.3–9.5）相(xiàng)比，Blue Native PAGE凝膠較低的工(gōng)作(zuò)pH（pH 7.5–7.7）有助于維持堿性pH敏感型蛋白(bái)質的非變性結構和/或活性。

2. Blue Native PAGE凝膠應如(rú)何保存？

我們推薦将其保存在4-8℃。不可(kě)冷(lěng)凍。

3. Blue Native PAGE凝膠的蛋白(bái)分(fēn)離(lí)範圍是多少？

3-12%RealPAGE Native BN/CN 預制膠可(kě)分(fēn)離(lí)分(fēn)子量在45–10,000 kD範圍内的蛋白(bái)質。

4-16%RealPAGE Native BN/CN 預制膠可(kě)分(fēn)離(lí)分(fēn)子量在25–10,000 kD範圍内的蛋白(bái)質。

4. Blue Native PAGE凝膠的推薦樣品上樣體(tǐ)積和蛋白(bái)質上樣量是多少？

我們提供的預制膠是12孔，每個孔的最大(dà)上樣體(tǐ)積爲30 μl，推薦每個泳道的蛋白(bái)含量範圍在20-50 μg。

5. 我的Blue Native PAGE凝膠在電泳過程中停止電泳了,爲什麽？該如(rú)何繼續電泳？

在Blue Native PAGE凝膠電泳期間，電流下降至低于1 mA很常見(jiàn)。有些電泳電源如(rú)伯樂電源有負載檢查功能，電流過低（低于4mA） 會認爲沒有負載，報錯E1錯誤代碼，終止電泳。解決方法是更換電泳電源，如(rú)使用國(guó)産電源；另外可(kě)以調高電壓高于300 V，使得(de)電流不要低于4mA。

推薦使用RTD6137 非變性電泳蛋白(bái)質Marker（45-880 kD），RTD6142 高分(fēn)子量非變性電泳蛋白(bái)質Marker II（45-669 kD）或者RTD6144 寬分(fēn)子量非變性電泳蛋白(bái)質Marker 21-880 kD。然而由于凝膠濃度較低，低于45 kD條帶會壓在前沿，可(kě)能不可(kě)見(jiàn)。

在Blue Native PAGE電泳中，不能使用預染分(fēn)子量Marker，因爲所有的預染蛋白(bái)分(fēn)子量Marker都(dōu)是經過變性和還(hái)原的，在非變性凝膠上不能良好分(fēn)離(lí)。

請(qǐng)注意，即使使用非變性分(fēn)子量Marker，在非變性電泳中的分(fēn)子量預估也是非常不精确的，因爲各蛋白(bái)質的不同電荷和結構會嚴重影(yǐng)響凝膠遷移。爲獲得(de)更精确的預估，可(kě)使用質譜分(fēn)析或排阻層析（SEC）。

7. 你(nǐ)們推薦對Blue Native PAGE凝膠使用哪種染色方法？

Blue Native PAGE凝膠可(kě)兼容大(dà)多數标準Coomassie R-250或G-250染料配方。推薦使用FastBlue蛋白(bái)染色液（貨号：RTD6202）。

8. 5% G-250染料的作(zuò)用是什麽？是否含有洗滌劑？

5% G-250染料（貨号BC260）是一種濃縮型Coomassie G-250儲液，專爲與含有洗滌劑（非離(lí)子型）的Blue Native PAGE凝膠電泳樣品一起使用而設計(jì)。該染料不含洗滌劑。正常情況下，非變性蛋白(bái)在凝膠上的遷移取決于凝膠緩沖液pH下的自(zì)然電荷/等電點，但(dàn)是，加入Coomassie G-250會使蛋白(bái)質産生(shēng)負電荷，即使是通常具有正電荷的高pI蛋白(bái)質也能帶上負電。該添加劑能夠與蛋白(bái)質非特異性結合，能夠保持蛋白(bái)的非變性狀态。

9. 你(nǐ)們推薦選擇哪種轉膜緩沖液用于Blue Native PAGE凝膠轉印？

我們推薦選擇10×BN轉膜緩沖液（貨号：BC600P）用于Blue Native PAGE凝膠轉印。PVDF是推薦使用的印迹膜，具有良好的轉印和檢測效果。硝酸纖維素膜（NC膜）不能兼容Blue Native PAGE凝膠轉印，這是因爲硝酸纖維素膜可(kě)與Coomassie G-250染料發生(shēng)緊密結合，很難脫離(lí)幹淨。

10. 對于Blue Native PAGE凝膠，你(nǐ)們推薦的轉膜條件(jiàn)是什麽？

由于Blue Native PAGE電泳基本關注的是分(fēn)子量比較大(dà)的蛋白(bái)或複合體(tǐ)，推薦使用濕轉法轉膜，不推薦用半幹轉方法轉膜。使用BN轉膜緩沖液，以下轉膜條件(jiàn)僅供參考，客戶針對自(zì)己的目的蛋白(bái)，最好經過1-2次預實驗後，确定最佳的轉膜條件(jiàn)。

11. 凝膠轉膜後，我的PVDF膜染上藍顔色了怎麽辦？

由于電泳緩沖液和上樣緩沖液中含有考馬斯亮藍G-250，凝膠轉膜後PVDF膜會有藍色痕迹，可(kě)以把膜浸泡在無水甲醇中漂洗幾分(fēn)鍾，去(qù)除藍色。

12. 非變性Marker轉到膜上看(kàn)不到條帶，Western Blot檢測後我如(rú)何判斷條帶大(dà)小呢(ne)？

有兩種方法可(kě)以解決非變性Marker轉膜後條帶顯示問(wèn)題：

第一種方法：凝膠轉膜後用麗春紅(hóng)染色液（貨号：RTD6301）染膜，可(kě)以看(kàn)到Marker條帶，順便可(kě)以檢測轉膜效率，然而要注意的是麗春紅(hóng)染色靈敏度比較低，可(kě)能不能完全看(kàn)到完整的Marker條帶。

       注：北京師(shī)範大(dà)學惠贈圖片

第二種方法（下圖）：電泳結束後，把含有Marker泳道的凝膠切下，單獨用考馬斯亮藍染色液染色（貨号：RTD6202），剩餘的凝膠去(qù)完成轉膜到ECL發光(guāng)檢測過程，最後的發光(guāng)結果和Marker染色結果拼接判斷條帶範圍。