Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠）
Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit Ver.731072
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貨号
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名稱
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包裝
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RTD6140
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Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(手灌膠)
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10 次
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● 貨品内容：
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組份
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貨号
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名稱
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規格
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保存
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1
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RTD6140-01
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2×BN/CN凝膠緩沖液
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40 ml
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4℃
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2
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AC2914-30ml
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40%
PAA（29:1）
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30 ml
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4℃
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2
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BC500P
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10×BN/CN PAGE電泳緩沖液(幹粉)
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500 ml
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RT
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3
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PL114-01
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上樣緩沖液
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1 ml
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-20℃
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4
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BC270
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2% G-250染料（電泳用）
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20 ml
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4℃
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5
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BC260-01
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5% G-250染料（上樣用）
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1 ml
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4℃
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6
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SR0510
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濃縮膠紅(hóng)色添加染料(200×)
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0.5 ml
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RT
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7
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AP020P
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APS（幹粉）
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0.5 g
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RT(配制後-20℃貯存)
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8
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TA0761
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TEMED
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0.5 ml
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4℃ 避光(guāng)
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9
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說(shuō)明書(shū)
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一份
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● 産品簡介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一種從(cóng)生(shēng)物樣品（質膜，胞漿等）中分(fēn)離(lí)分(fēn)子量10 kD-10 M kD 範圍的蛋白(bái)質複合物的電泳技術(shù)。其原理(lǐ)是用溫和去(qù)污劑(如(rú) DDM，digitonin)将蛋白(bái)複合體(tǐ)從(cóng)細胞膜中以近似天然的狀态分(fēn)離(lí)出來(lái)，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬斯亮藍 G-250 代替 SDS與蛋白(bái)結合而使其帶負電荷，根據蛋白(bái)分(fēn)子量不同在 PAGE膠中得(de)到分(fēn)離(lí)；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是電泳緩沖液中不加入任何染料，電泳中始終保持蛋白(bái)的天然電荷和活性狀态，然而，其蛋白(bái)的分(fēn)辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考馬斯亮藍G-250存在，使蛋白(bái)都(dōu)覆蓋上負電荷，可(kě)以分(fēn)離(lí)堿性蛋白(bái)（pI＞7）和酸性蛋白(bái)(pI＜7)；而CN-PAGE隻适合于酸性蛋白(bái)（pI＜7）的分(fēn)離(lí)。
本産品包括BN/CN-PAGE制膠的所有成分(fēn)，方便使用。可(kě)以用于分(fēn)離(lí)分(fēn)子量在 10 kD-500 kD 的蛋白(bái)複合體(tǐ)，樣品可(kě)以來(lái)于胞漿、細胞總裂解液、細胞膜、線粒體(tǐ)膜和葉綠體(tǐ)膜等。電泳後可(kě)直接用于考染、銀染、Western 雜交、SDS-PAGE電泳、蛋白(bái)純化、蛋白(bái)活性檢測等分(fēn)析實驗，也可(kě)直接用于電洗脫制備蛋白(bái)。
試劑盒配套有紅(hóng)色濃縮膠添加染料,凝固後的濃縮膠爲紅(hóng)色,有利于在藍色電泳緩沖液中觀察加樣孔,方便上樣。
本試劑盒大(dà)約可(kě)以配制8-25塊常規大(dà)小（8×10 cm）PAGE凝膠，具體(tǐ)數量根據凝膠濃度和厚度決定，1 mm厚度8%凝膠可(kě)以配制至少10塊膠。
● 運輸和貯存：
本産品常溫運輸；組份按照(zhào)标簽溫度貯存；有效期一年(nián)。
● 使用說(shuō)明：
一. 樣品制備：
該試劑盒不含樣品制備的相(xiàng)關試劑，根據樣品種類，具體(tǐ)選擇不同提取方法。植物類囊體(tǐ)BN樣品制備可(kě)以選擇植物類囊體(tǐ)膜提取試劑盒（貨号：RTU5002）；動物總蛋白(bái)BN樣品制備可(kě)以選擇動物胞漿活性蛋白(bái)提取試劑盒（不含去(qù)垢劑，離(lí)心柱法）（貨号：RTD8106）；動物膜蛋白(bái)BN樣品制備可(kě)以選擇動物膜蛋白(bái)提取試劑盒(細胞)（貨号：RTD8111）和動物膜蛋白(bái)提取試劑盒(組織)（貨号：RTD8112）；動物線粒體(tǐ)BN樣品制備可(kě)以選擇動物細胞線粒體(tǐ)提取試劑盒（貨号：RTD8115）和動物組織線粒體(tǐ)提取試劑盒（貨号：RTD8117）。
二. 制膠：
2.1 分(fēn)離(lí)膠制備：
2.1.1 不同濃度的分(fēn)離(lí)膠的最佳分(fēn)離(lí)範圍：
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分(fēn)離(lí)膠濃度
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最佳分(fēn)離(lí)範圍
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6%
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80-500 kD
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8%
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50-350 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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2.1.2根據表一，将不同體(tǐ)積的成分(fēn)在小燒杯中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡
2.1.3在凝膠模具中灌入适量分(fēn)離(lí)膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃闆頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可(kě)），然後在分(fēn)離(lí)膠溶液上輕輕覆蓋一層1-3 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
2.1.4靜(jìng)置15-30分(fēn)鍾，待分(fēn)離(lí)膠和水層之間出現一個清晰的界面後，說(shuō)明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
表一 Blue/Clear Native PAGE分(fēn)離(lí)膠配方表
（以一塊1.0 mm厚度mini膠爲例）
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分(fēn)離(lí)膠總體(tǐ)積 5 ml
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6%
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8%
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10%
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12%
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15%
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組份
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組份加入體(tǐ)積（ml）
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滅菌水
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1.7
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1.45
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1.2
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0.95
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0.57
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2×BN/CN凝膠緩沖液
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2.5
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2.5
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2.5
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2.5
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2.5
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40％ PAA（29:1）
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0.75
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1
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1.25
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1.5
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1.875
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10％ APS
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0.05
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0.05
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0.05
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0.05
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0.05
|
|
TEMED
|
0.005
|
0.005
|
0.005
|
0.005
|
0.005
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2.2 濃縮膠制備：
2.2.1去(qù)除覆蓋在分(fēn)離(lí)膠上的水層。
2.2.2按照(zhào)表二将不同成分(fēn)在一個小燒杯中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免産生(shēng)氣泡。
2.2.3将濃縮膠溶液加至分(fēn)離(lí)膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃闆的頂端。
2.2.4将梳子插入凝膠内，避免産生(shēng)氣泡。
2.2.5靜(jìng)置30-60分(fēn)鍾，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快(kuài)；冬天氣溫低時，聚合時間會延長。可(kě)以根據環境溫度的不同調節APS的加入量。
表二 Blue/Clear Native PAGE濃縮膠（4%）配方表（以一塊1.0mm厚度mini膠爲例）
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組份
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不同凝膠體(tǐ)積對應各組份的取樣量
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濃縮膠總體(tǐ)積2 ml
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H2O
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0.8 ml
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2×BN/CN凝膠緩沖液
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1 ml
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40％ PAA（29:1）
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0.2 ml
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濃縮膠紅(hóng)色添加染料(200×)
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10 μl
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10％ APS
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20 μl
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TEMED
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2 μl
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三. 電泳：
3.1 準備電泳緩沖液：
将10×BN/CN PAGE電泳緩沖液（幹粉）溶于500 ml滅菌水中，徹底溶解，測定pH應爲7.0左右，不要調節pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。
3.1.1 CN-PAGE電泳：
陽極緩沖液和陰極緩沖液均直接使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液進行電泳。
3.1.2 BN-PAGE電泳：
陽極緩沖液(外槽)使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，陰極緩沖液(内槽)按照(zhào)下表配制：
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1×藍色陰極緩沖液
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150 ml
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10×BN/CN PAGE電泳緩沖液
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15
ml
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2% G-250 染料（電泳用）
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1.5 ml
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超純水
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定容至150
ml
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3.2 準備樣品：
3.2.1 CN-PAGE電泳：
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總體(tǐ)積
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10
μl
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蛋白(bái)樣品
|
x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上樣緩沖液
|
2.5 μl
|
|
超純水
|
補至10 μl
|
|
|
不要加熱(rè)
|
3.2.2 BN-PAGE電泳：
3.2.2.1
植物類囊體(tǐ)膜蛋白(bái)電泳：
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總體(tǐ)積
|
10
μl
|
|
|
含去(qù)垢劑樣品*
|
|
植物類囊體(tǐ)膜蛋白(bái)樣品
（2%DDM增溶）
|
x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上樣緩沖液
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2.5 μl
|
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5%
G-250染料（蛋白(bái)上樣）
|
1 μl
|
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超純水
|
補至10 μl
|
|
|
不要加熱(rè)
|
*植物類囊體(tǐ)膜蛋白(bái)電泳中，含去(qù)垢劑樣品中染料加入按照(zhào)以下原則：
植物類囊體(tǐ)樣品中G250終濃度爲去(qù)垢劑終濃度的1/4。例如(rú)樣品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度爲2%，則需要G-250終濃度爲0.5%。10 μl蛋白(bái)樣品中需要加5%
G-250染料1 μl。
3.2.2.2
動物線粒體(tǐ)BN樣品電泳：
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總體(tǐ)積
|
10
μl
|
|
|
含去(qù)垢劑樣品*
|
|
動物線粒體(tǐ)BN樣品
（1%DDM增溶）
|
x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上樣緩沖液
|
2.5 μl
|
|
5%
G-250染料（蛋白(bái)上樣）
|
0.25 μl
|
|
超純水
|
補至10 μl
|
|
|
不要加熱(rè)
|
*動物線粒體(tǐ)BN樣品電泳中，含去(qù)垢劑樣品中染料加入按照(zhào)以下原則：
動物線粒體(tǐ)BN樣品中G250終濃度爲去(qù)垢劑終濃度的1/8。例如(rú)樣品中DDM終濃度爲1%，則需要G-250終濃度爲0.125%。10 μl蛋白(bái)樣品中需要加5% G-250染料0.25 μl。
3.2.2.3
不含去(qù)垢劑樣品：
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總體(tǐ)積
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10
μl
|
|
不含去(qù)垢劑樣品
|
x μl
|
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4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上樣緩沖液
|
2.5 μl
|
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5%
G-250染料（蛋白(bái)上樣）
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- #
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超純水
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補至10 μl
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|
|
不要加熱(rè)
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# 不含去(qù)垢劑樣品可(kě)以不必添加5%G-250染料。
3.3電泳過程；
3.3.1 CN-PAGE電泳：
電泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。在電泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕撥出預制膠梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次，随後在電泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。
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CN-PAGE電泳
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時間
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120V
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10-15mA/闆膠
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4-10mA/闆膠
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50+min
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注：冰浴電泳
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3.3.2 BN-PAGE電泳：
BN-PAGE電泳外槽使用1×BN/CN電泳緩沖液；内槽開始電泳使用的是1×藍色陰極緩沖液，冰浴電泳，等待電泳指示前沿到達距離(lí)凝膠頂部2/3處時，将電泳緩沖液更換爲1×BN/CN電泳緩沖液，繼續後續電泳，因爲過多染料會影(yǐng)響蛋白(bái)在凝膠中的遷移以及蛋白(bái)後續的轉膜實驗。
BN-PAGE電泳條件(jiàn)（一闆膠）
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恒電壓
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起始電流
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電泳時間
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緩沖液
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120 V
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8-15 mA
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20-25
min
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1×藍色陰極緩沖液
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冰浴電泳
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指示前沿至凝膠頂部三分(fēn)之二處，更換内槽緩沖液爲無色1×BN/CN
電泳緩沖液
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恒電壓
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繼續電泳時間
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結束電流
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緩沖液
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120 V
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45 min
+
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3-5 mA
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1×BN/CN電泳緩沖液
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冰浴電泳
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四. 轉膜：
BN-PAGE轉膜必須用PVDF膜，不能用NC膜，因爲NC膜與G-250結合非常緊密。
轉膜緩沖液可(kě)以使用10×BN轉膜緩沖液（貨号：BC600P）。
五. 染色：
5.1 将電泳後的PAGE膠取下放(fàng)入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白(bái)染色液（以剛剛覆蓋過膠面爲适），條帶1-2分(fēn)鍾即可(kě)見(jiàn)。
5.2 搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至條帶清晰可(kě)見(jiàn)。
5.3 加入适量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分(fēn)鍾至背景幹淨。
5.4 觀察保存結果。
六. 實驗示例：
RTD6140 Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠） WB檢測
樣品處理(lǐ)：K562懸浮細胞提取胞漿活性蛋白(bái)（貨号：RTD6106 動物活性蛋白(bái)提取試劑盒（不含去(qù)垢劑））
4×BN/CN-PAGE蛋白(bái)上樣緩沖液（貨号：PL114） 調整蛋白(bái)濃度爲1μg/μl上樣液，梯度上樣5-20μg
電泳：8% BN手灌膠，穩壓200V 1×藍色陰極緩沖液至指示前沿距離(lí)膠上沿2/3處，
更換爲無色1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，電泳時間共83分(fēn)鍾
轉膜：0.45 μm PVDF膜，10×BN轉膜緩沖液（貨号：BC600P）稀釋爲1×BN轉膜緩沖液加20%甲醇，
恒流200mA 2小時，未冰浴。
轉膜效果檢測：膜用麗春紅(hóng)染色液染色（貨号：RTD6301）有可(kě)見(jiàn)條帶，膠用FastBlue蛋白(bái)染色液染色
（貨号：RTD6202）幾乎無條帶，證明轉膜成功。膜用無水甲醇清洗5分(fēn)鍾去(qù)除膜上藍色殘餘。
封閉：Western快(kuài)速封閉液（貨号：WR5020） RT 封閉10 分(fēn)鍾；
一抗：兔單抗GAPDH 1:10000 RT 60min；二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，
ECL檢測：RealECL發光(guāng)液（貨号：EC2520），曝光(guāng)1秒。
使用RTD6140
Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠）産品發表部分(fēn)文章(zhāng)列表：
1.
[2022 IF=2.9] Identification and structural analysis of
dimeric chicken complement
component 3d and its binding with
chicken complement receptor 2.
Author: Huan Jin, Min Tu, Zhaoying Meng, Bo Jiang,
Qianqian Yang, Yongqing Li,Zhenhua Zhang
Journal: Developmental and Comparative Immunology 152
(2024) 105109
Institution: Institute
of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agriculture and
Forestry Sciences
Paper link：https://doi.org/10.1016/j.dci.2023.105109