高分(fēn)子量蛋白(bái)（大(dà)于150 kD）Western Blot攻略

高分(fēn)子量蛋白(bái)（大(dà)于150 kD）Western Blot攻略

注：該文引自(zì)基因幫公衆号天才試劑君文章(zhāng)，略有修改。  Ver.730875

● 一 選對凝膠很重要

三種最常見(jiàn)的凝膠系統包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate系統。

Tris-Glycine凝膠的pH爲8.6，且保質期很短(duǎn)，一般4-8℃保存有效期一個月。在跑膠的過程中，凝膠系統的pH還(hái)有上升的趨勢，可(kě)達到9.5，這會導緻蛋白(bái)降解和低分(fēn)辨率。

Bis-Tris凝膠的pH爲~6.5，相(xiàng)對Tris-Glycine凝膠，穩定性和保質期都(dōu)有所增加，4-8℃貯存可(kě)以保存一年(nián)。但(dàn)這種凝膠更适合于低分(fēn)子量電泳分(fēn)離(lí)（低于200 kD），不适合高分(fēn)子量蛋白(bái)電泳。

Tris-Acetate 凝膠的pH爲~7，跑大(dà)分(fēn)子蛋白(bái)會呈現很高的分(fēn)辨率，同時4-8℃貯存可(kě)以保存一年(nián)。

所以跑大(dà)分(fēn)子蛋白(bái)時，我們推薦使用Tris-Acetate 凝膠（貨号：RTD6162；RTD6155）。

● 二 凝膠濃度很重要

既然選擇了Tris-Acetate 凝膠，要考慮凝膠濃度的問(wèn)題。凝膠濃度與孔徑成反比：濃度越小，孔越大(dà)，較大(dà)的蛋白(bái)質更容易通過較大(dà)的孔，所以建議(yì)使用低百分(fēn)比的Tris醋酸凝膠（貨号：RTD6162），如(rú)6％等度膠。也可(kě)以使用梯度凝膠，但(dàn)是制作(zuò)梯度凝膠會恨棘手，需要一個梯度凝膠生(shēng)成系統（貨号：RT-GZY02），不過現在很多公司都(dōu)會出售具有不同範圍的梯度預制膠（貨号：RTD6155），節省時間。

● 三 電泳内槽緩沖液需要添加抗氧化劑

Tris-醋酸電泳使用10×Tris-醋酸-SDS電泳緩沖液（貨号：TA050），經典的Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液無法兼容使用。由于DTT在pH中性時，基本不随着樣品泳動，爲保證蛋白(bái)樣品在電泳中維持還(hái)原力，Tris-Acetate 凝膠電泳時，電泳槽内槽緩沖液需要添加抗氧化劑（貨号：TA1510），這樣可(kě)以保證整個電泳過程中蛋白(bái)的變性還(hái)原狀态，提高樣品的分(fēn)辨率。

● 四 提高轉膜緩沖液中的SDS，減少甲醇

高分(fēn)子量蛋白(bái)轉膜緩沖液中的組成至關重要。如(rú)果有甲醇存在，大(dà)分(fēn)子蛋白(bái)很容易沉澱，可(kě)以通過減少轉膜緩沖液中的甲醇百分(fēn)比（10％或更低）來(lái)避免這種情況發生(shēng)。爲了進一步确保蛋白(bái)質不會沉澱，考慮在轉膜緩沖液中添加SDS至終濃度爲0.05%-0.1％。SDS向蛋白(bái)添加均勻的負電荷，使得(de)它們更容易從(cóng)凝膠轉移到膜上。高分(fēn)子量蛋白(bái)的轉膜緩沖液可(kě)以選擇10×Tris-醋酸轉膜緩沖液（濕轉，粉末型）（貨号：TA5030P）

● 五 選擇合适的轉印膜

轉印膜一般有PVDF膜或NC膜，跑大(dà)分(fēn)子蛋白(bái)建議(yì)選擇PVDF膜。如(rú)前面所說(shuō)，如(rú)果有甲醇存在，大(dà)分(fēn)子蛋白(bái)很容易沉澱。而PVDF膜可(kě)以不需要在轉膜緩沖液中添加甲醇，目的蛋白(bái)轉印的機(jī)會更高。PVDF膜有各種孔徑尺寸，最常見(jiàn)的是0.22 μm和0.45 μm。與凝膠一樣，較大(dà)的蛋白(bái)比較小的蛋白(bái)更容易穿過大(dà)孔隙。高分(fēn)子量蛋白(bái)質可(kě)以用0.45μm膜（貨号：ML-PV-131545-5）轉移，避免使用0.22 μm孔徑。

● 六 增加轉印時間

在正确的選擇完凝膠、轉印膜及轉移緩沖液後，轉印正式開始。半幹轉快(kuài)且方便，但(dàn)不适用于大(dà)分(fēn)子蛋白(bái)。大(dà)分(fēn)子蛋白(bái)建議(yì)濕轉，因爲大(dà)分(fēn)子蛋白(bái)轉移時間很慢(màn)，推薦350-400 mA轉移90 min或 4℃，40 mA，轉印過夜。

● 七 關于轉印膜封閉

沒有任何一種封閉試劑能通用于蛋白(bái)封閉。BSA通常作(zuò)爲NC膜的封閉液，但(dàn)是對于PVDF膜，它的封閉效果并不是最好。大(dà)蛋白(bái)轉膜後的封閉可(kě)以選擇5%脫脂奶粉（貨号：WN1070）。

另外，不要讓PVDF膜在檢測過程中的任何時間點幹透，如(rú)果膜部分(fēn)變幹，可(kě)以讓膜完全幹掉，然後用甲醇重新潤濕，之後用緩沖液浸泡，繼續操作(zuò)。